腺相关病毒(Adeno-associated Virus,AAV) 属于细小病毒科(parvoviridae)单链DNA病毒。病毒基因组约 4700bp,包括2个145nt的反向末端重复序列(ITR)以及位于两者之间的上下游两个开放读码框架(ORF),分别编码 rep和 cap。cap 基因编码病毒衣壳蛋白,rep 基因参与病毒的复制和整合。AAV 能感染多种细胞。rep 基因产物存在时,病毒 DNA很容易整合到人类第19号染色体。
AAV 是一种复制缺陷型微小病毒,通常需要在辅助病毒(如腺病毒、单纯疱疹病毒等)的辅助下才能发生产毒性感染,生成子代 AAV。艾基生物采用 AAV无辅助病毒系统 (AAV Helper-Free System),在无辅助病毒的条件下生产重组腺相关病毒。在这个系统中,rep 和 cap基因从病毒载体中被转移到辅助质粒 pAAV-RC中,而AAV ITRs仍位于病毒载体中。生产 AAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物(包括 E2A,E4 等基因)大部分则由 pHelper质粒提供,其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒 E1基因的宿主细胞提供。在辅助质粒的帮助下,仅需两端的 ITR就能将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒,因此,rep 和 cap基因的转移后空出的位置可以允许外源基因插入病毒基因组中。
►【腺相关病毒的优点】
- 安全性高:重组腺相关病毒载体(rAAV) 源于非致病的野生型腺相关病毒。迄今为止尚未发现对人体致病的野生型AAV 。重组AAV 在基因组序列上去 除了大部分的野生型AAV 基因组元件,进一步保证了安全性。
- 免疫原性低:进行动物实验时造成的免疫反应小。
- 宿主范围广:能感染分裂细胞和非分裂细胞。
- 表达稳定:能介导外源基因体内长时间稳定表达。
- 物理性质稳定:可抗氯仿,在60℃不能被灭活。
►【包装流程】
►【AAV病毒载体血清型】
研究发现 AAV 具有多种血清型,各种不同血清型的 AAV 载体的主要区别是衣壳蛋白不同。AAV进入细胞前,首先要通过衣壳蛋白与细胞表面的相应受体结合进而附着于细胞表面,随后再通过与其它复合受体的相互作用来起始病毒颗粒的细胞内转运等生物学活动。因此AAV不同血清型对不同的组织和细胞亲和性不同,体现出AAV血清型对不同组织器官的转染效率存在差异。目前AAV可分为13种血清型。艾基生物可针对不同的 组织器官类型选择相应血清型的 AAV 病毒进行包装。
不同血清型对各组织器官细胞的亲和性
组织 | 最适血清型性 |
中枢神经 | AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9 |
心脏 | AAV1, AAV8, AAV9 |
肾脏 | AAV2 |
肝脏 | AAV7, AAV8, AAV9 |
肺 | AAV4, AAV5, AAV6, AAV9 |
胰脏 | AAV8 |
骨骼肌 | AAV1, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 |
感光受体细胞 | AAV2, AAV5, AAV8 |
视网膜色素细胞 | AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8 |
►【提供服务】
- AAV载体构
- 干扰腺病毒(shRNA和 miRNA)包装
- 过表达腺病毒的包装
►【服务内容】
1ml浓缩病毒液,滴度1010-1012v.g/ml:
实验步骤 | 服务周期(工作日) |
基因合成 | 6-10 |
载体构建 | 5-7 |
腺相关病毒包装(<1.5kb、shRNA) | 7-10 |
腺相关病毒包装(1.5kb-3kb) | 7-10 |
浓缩纯化 | 2-3 |
qPCR滴度测定 | 1-2 |